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NY/T 1951-2010 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范
日期:2017-10-18

NY/T 1951-2010

蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范

(2010-09-21发布,2010-12-01实施)

 

1  范围

本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。

本标准适用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病及蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断和检疫。

2  蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法

2.1原理

蜜蜂美洲幼虫腐臭病(Amcrican foulbrood disease)是由幼虫芽孢杆菌(Puenibacillus Larvae Larvae

White)引起蜜蜂幼虫和蛹的急性和毁灭性细菌性病害,主要侵害西方蜜蜂。

2.2试剂、设备和材料

2.2.1材料和试剂

2.2.1.1无菌平皿。

2.2.1.2载玻片。

2.2.1.3试管(10 mL)。

2.2.1.4微量移液器。

2.2.1.5小离心管(1.5 mL)。

2.2.1.6 PCR管(200uL)。

2.2.1.7胡萝卜酵母培养基。

2.2.1.8马铃薯培养基。

2.2.1.9酵母浸膏培养基。

2.2.1.10牛肉膏琼脂平板。

2.2.1.11 5%孔雀绿水溶液。

2.2.1.12 0.5%沙黄水溶液。

2.2.1.13碱性美蓝(又称骆氏美蓝)染色液。

 

2.2.1.14 2%石炭酸复红染液。

2.2.1.15 5%的醋酸。

2. 2.1.16无菌生理盐水。

2.2.1.17无菌蒸馏水。

2.2.1.18 PCR引物。

2.2.1.20 10XPCR缓冲液。

2.2.1.21 dNTP。

2.2.1.22 0.8%琼脂糖凝胶。

2.2.1.23  TAE电泳缓冲液(见表1)。

表1  TAE电泳缓冲液参数

缓冲液

使用液

浓贮存液(每升)

Tris-乙酸(TAE)

1×0.04 mol/L Tris-乙酸

50×242 g Tris碱

 

0. 001 mol/L EDTA   

57.1 mL冰乙酸

 

 

100 mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

2.2.1.24 琼脂糖凝胶和凝胶加样缓冲液。

0.8%琼脂糖凝胶配置:2.4 g琼脂糖,加入20。mL TAE电泳缓冲液,加热溶解后,用TAE电泳缓冲液定容至300 mL,略冷后加入15uL溴化乙啶(EB)溶液,混匀。

加样缓冲液配制见表2。

表2  加样缓冲液配置

O.25%溴酚蓝

40% (w/v)蔗糖水溶液

2.2.2设备

2.2.2.1普通光学显微镜。

2.2.2.2恒温培养箱。

2.2.2.3恒温水浴箱。

2.2.2.4高速离心机。

2.2.2.5 PCR仪(热循环仪)。

2.2.2.6琼脂糖凝胶电泳仪。

2.2.2.7紫外凝胶成像系统。

2.3方法及判定

2.3.1症状诊断法

幼虫的巢房盖变潮湿、下陷,颜色发暗并显油光,大部分穿孔;封盖幼虫死亡,死亡的蛹的喙常从腐烂虫尸前端穿出,形如伸出的舌状;若揭开房盖,用一根火柴杆插入虫体再拉出来,可拉出2 cm~3 cm长的胶体状细丝。病死幼虫的尸体大约一个月后干枯成一片难以剥落的痂皮,贴在房壁上。

2.3.2微生物学诊断法

2.3.2.1取备检幼虫样品1只~2只置于组织研磨器内,加l mL~2 mL灭菌生理盐水制成悬浮液。

2.3.2.2将上述悬浮液(也可将悬浮液在800C水浴中10 min,以杀死不形成芽孢的细菌再接种)接种于胡萝卜酵母琼脂(参见A.1)平板培养基或马铃薯培养基(参见A.2)、酵母浸膏(参见A.3)培养基上。

置于恒温培养箱中,在30℃~32℃条件下培养24h~48 h。

2.3.2.3挑取单个可疑茵落,于上述培养条件下培养24 h~48 h。挑取纯培养后的菌落做涂片,进行孔雀绿、沙黄芽孢染色或石炭酸复红和碱性美蓝染色。

2.3.2.4孔雀绿、沙黄芽孢染色法。将2.3.2.3制备的涂片经火焰固定后,加5%孔雀绿水溶液(参见B.1)于载玻片上,加热汽腾3 min~5 min,用蒸馏水冲洗后,加o.5%沙黄水溶液(参见B.2)复染1 min,蒸馏水冲洗,用滤纸吸干,在普通光学显微镜(1000×)下检查。

结果判定:如发现镜下观察到的菌体呈蓝色,芽孢呈红色,即可初步判定非欧洲幼虫腐臭病病原引起的感染。但进一步诊断还需进行生化诊断法。

2.3.2.5石炭酸复红和碱性美蓝染色法。将上述制备的涂片经火焰固定后,加稀释石炭酸复红液(参见B.3)于载玻片上,加热汽腾2 min~5 min,用蒸馏水冲洗后,用5%醋酸褪色,至淡红色为止(约10 s),以骆氏美蓝液(参见B4)复染o.5 min,用蒸馏水冲洗,吸干或烘干,在普通光学显微镜(1 000×)下检查。

结果判定:如发现镜下观察到的菌体呈蓝色,芽孢呈红色,即可初步判定非欧洲幼虫腐臭病病原引起的感染。但进一步诊断还需进行生化诊断法。

2.3.3生化诊断法

美洲幼虫腐臭病芽孢杆菌能分解葡萄糖、半乳糖、果糖,产酸不产气,不分解乳糖、蔗糖、甘露醇、卫矛醇;不水解淀粉;不产生靛基质,缓慢液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐。

2.3.4牛乳诊断法

取新鲜牛奶2 mL~3 rnL置试管中,同时加入被检的样品或经纯化的菌落少许,充分混匀;置于恒温培养箱中,在30℃N320C条件下培养1 h~2 h。

结果判定:若发现牛奶发生凝集,随后又发生水解的现象,为牛乳实验阳性。再结合症状和微生物学诊断,结果即可判定被检幼虫样品为美洲幼虫腐臭病。为进一步确诊,可参考PCR诊断法。

2.3.5 PCR诊断法

2.3.5.1 DNA模版制备

取两只被检的幼虫,置于小离心管中,加入1 rnL无菌蒸馏水后充分混匀,制成悬浮液。取上述悬浮液100 uL,加入900uL无菌蒸馏水稀释。混匀后,再取100 uL稀释的悬浮液,95℃水浴15 min,在5 000r/min条件下离心5 min,即成为DNA模版,用于PCR反应。

也可先将被检幼虫制成悬浮液用胡萝卜酵母培养基进行分离培养,再将可疑菌落在上述培养基上进行纯培养,培养条件:37℃,3d~4d;利用显微镜1 500倍进行镜检。当观察到大量杆状细菌时,用1 mL灭菌水将菌苔悬浮,悬浮液浓度约为1.0×107 cfu/mL,将菌液在1000 g,离心5min,将收集的菌液用灭菌纯水洗涤一次,再用100uL灭菌纯水悬浮;将上述菌液进行水浴处理,95℃,15 min,在10 000g,离心2 min,取10 uL上清液作为PCR反应的模版DNA。

2.3.5.2 PCR反应条件

50 uL PCR反应体系:50 pmol正向和反向引物(引物序列见表1),4uL_脱氧核苷三磷酸混合物(各2.5 mmol/L)、5uL的10×PCR Buffer(Mg2+ Plus)及1.5 U的Taq聚合酶。

 

 

表3  引物序列的信息

方 向

序 列

PCR产物大小

正向

5'- CTT GTG TTT CTTT CGG GAG ACG CCA - 3'

1106 bp

反向

5'- TCT TAG AGT GCC CAC CTC TGCG - 3'

 

表4  检测美洲幼虫腐臭病PCR反应条件

预变性   

95℃

5min

30个循环

93℃

lmin

 

55℃

30 s

 

72℃

1min

延伸

72℃

5min

2.3.5.3 用0.7%琼脂糖凝胶电泳及演化乙锭染色初步测定PCR产物片段的大小    取PCR反应后的样本10uL,浓度0.8%的琼脂糖凝胶,见上2.2.1.23和2.2.1.24。电压100 v,TAE电泳缓冲液进行电泳检验,用紫外凝胶成像系统进行观察。

结果判定:在阴性对照无条带,阳性对照在1106 bp有清晰条带时,如被测样品在1106 bp有清晰条带(图1),则可判定样品为PCR阳性。

图1  检测样品PCR产物电泳结果

泳道1:空白对照; 泳道2:检测样品1;泳道3:检测样品2;泳道4:阳性对照;泳道5:1OO bp ladder Marker

3  欧洲幼虫腐臭病诊断方法

3.1原理

    蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(Eurpcan foulbrood diseasc)是由蜂房蜜蜂球菌(Mclissococcus  pluton)引起的蜜蜂幼虫的一种细菌性传染病,主要侵害东方蜜蜂。

3.2试剂、设备和材料

3.2.1试剂和材料

3.2.1.1无菌平皿。

3.2.1.2载玻片。

3.2.1.3试管(10 mL)。

3.2.1.4微量移液器。

3.2.1.5小离心管(1.5 mL)。

3.2.1.6 PCR管(200 uL)。

3.2.1.7  2%石炭酸复红溶液。碱性复红4g,溶于95%乙醇10O mL中,再取此液10 mL,加入5%石炭酸水溶液90 mL,混匀即成。

3.2.1.8无菌生理盐水。

3.2.1.9牛肉膏琼脂平板。

3.2.1.10无菌蒸馏水。

3.2.1.11 PCR引物。

3.2.1.12 Taq聚合酶。

3.2.1.13 0×PCR缓冲液。

3.2.1.14 dNTP。

3.2.1.15 0.8%琼脂糖凝胶。

3.2.1.16 TAE电泳缓冲液,见上2.2.1.23;

3.2.1.17凝胶加样缓冲液,见2.2.1.24。

3.2.2设备

3.2.2.1普通光学显微镜。

3.2.2.2 C02培养箱。

3.2.2.3恒温水浴箱。

3.2.2.4高速离心机。

3.2.2.5 PCR仪(热循环仪)。

3,2.2.6琼脂糖凝胶电泳仪。

3.2.2.7紫外凝胶成像系统。

3.3方法与判定

3.3.1症状诊断

该病通常使2 d~4 d未封盖幼虫死亡。同时,患病幼虫又可随时被工蜂清除,形成卵、幼虫、空房相间的“插花子脾”。临床上,发现死亡幼虫呈黄自或暗褐色,并有酸臭气味,无黏性,未腐烂幼虫可透过表皮清晰见到皮下气管系统,即可疑为欧洲幼虫腐臭病。

3.3.2微生物学诊断法

3.3.2.1取备检幼虫样品1只-2只置于组织研磨器内,加1 mL~2 mL灭菌生理盐水涮成悬浮液。

3.3.2.2用接种环取上述悬浮液,以划线法接种于牛肉膏琼脂平板(参见A.4),置于5% C02培养箱中,在35℃~37℃条件下24 h-48 h。

3.3.2.3挑取单个可疑菌落,接种子牛肉膏琼脂平板,置于5%CO2培养箱中,在35℃~37℃条件下纯培养24 h-48 h。

3.3.2.4经过分离纯化的菌落,即可用接种环挑取菌落,放在干净的载玻片上,加1滴-2滴生理盐水,涂匀后风干或干燥。

3.3.2.5用2%石炭酸复红溶液染色1.5 min-2 min,水洗,用滤纸吸干。在普通光学显微镜下(1 000×~1 500×)检查。

结果判定:发现0.5umX10um大小成单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披针形球菌时,可初步判定样品受蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原感染。

3.3.3 PCR诊断法

3.3.3.1 DNA模版制备

取两只被检的幼虫,置于小离心管中,加入ImL无菌蒸馏水后充分混匀,制成悬浮液。取上述悬浮

液100 uL,加入900 uL无菌蒸馏水稀释。混匀后,再取100 uL稀释的悬浮液,95℃水浴15min,在5 000/min条件下离心5 min,即成为DNA模版,用于PCR反应。

3.3.2 PCR反应条件

PCR反应引物根据蜂房蜜蜂球菌l6 S rRNA基因片段设计,灵敏度高,特异性强。其序列如下:

MP16SF   5'- GAAGAGGAGTTAAAAGGCGC-3'

MP18SR   5'-TTATCTCAAGGCGTTCAAAGG-3'

50 uLPCR反应体系:5uL10×PCR缓冲液、1.25 UTaq聚合酶、两引物各50 pmol、200 pmol/LdNTP1uL制备的DNA模版(1uL无菌蒸馏水做阴性对照,1uL已知患病幼虫提取物为阳性对照)。

表5  检测欧洲幼虫腐臭病PCR反应条件

预变性

95℃

5 min

30循环

94℃

30 s

 

50℃

30 s

 

72℃

2 min

延伸

72℃

5 min

 

3.3取PCR反应后的样本10uL,浓度0.8%的琼脂糖凝胶,电压100 V,TAE电泳缓冲液,进行检验,用紫外凝胶成像系统进行观察。

结果判定:在阴性对照无条带,阳性对照在829bp有清晰条带时,则可判定为欧洲幼虫腐臭病PCR

附录A

(资料性附录)

培养基的制备

A.1胡萝卜酵母琼脂培养基

胰蛋白胨10 g,无水磷酸氢二钾0.5 g,琼脂3g,胡萝卜浸出液200 mL(将100 g洗净的胡萝卜磨碎,加入250 mL水,静置30 min,过滤而成),酵母浸出液3g,蒸馏水1 000 mL,pH 6.8。将上述多种成分加热溶解(胡萝卜浸出液在溶解后加入混匀),在0. 105 MPa的压力下,高温灭菌20 min。

A.2马铃薯培养基

将去皮马铃薯200 g切成片,加水1000 mL,煮沸30 min~40 min,过滤,将20g右旋葡萄糖和20 g琼脂趁热加入溶化,调节pH至7.O,在0.105 MPa的压力下,高温灭菌15 min。

A.3酵母浸膏培养基

酵母浸出液lg,葡萄糖lg,无水磷酸氢二钾1.36 g,琼脂2g,蒸馏水100 mL,pH 6.6,将以上各种成分混合溶解,在0.068 MPa的压力下,高温灭菌20 min。

A.4牛肉膏琼脂平板

牛肉膏lg,蛋白胨lg,氯化钠0.5 g,琼脂2g,蒸馏水100 mL,pH 7.O,将上述各种成分混合,加热溶解,在0.105 MPa的压力下,灭菌15min。

 

附录B

(资料性附录)

染色液的制备

B.1  5%孔雀绿水溶液

取5g孔雀绿,先将孔雀绿研细,加适量95%酒精溶液溶解,再加蒸馏水定容至1OO mL。

B.2 0.5%沙黄水溶液

取0.5 g沙黄,先将沙黄研细,加适量95%酒精溶液溶解,再加蒸馏水定容至IOO mL。

B.3 2%石炭酸复红染液

取3%复红酒精溶液10 rnL,加入5%石炭酸水溶液90mL,融合过滤,然后再用蒸馏水作10倍稀释。

B.4 碱性美蓝(又称骆氏美蓝】染色液

取美蓝饱和酒精溶液30 mL,加入0.01%氢氧化钾水溶液100 mL,混合即成。

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